西安干细胞技术研究的发展历程（上）

干细胞是生命诞生、维系组织器官结构与功能完整的基础，是组织细胞更新换代和损伤修复的种子，是生命的源泉。干细胞显著的特点是具有自我更新和无限增殖的能力，同时具有高度可塑性，即具有多向分化潜能。因此，我们可以把干细胞定义为：干细胞是来源于早期胚胎或成体组织、具有自我更新和高度增殖能力且至少可以跨胚层分化为2种以上不同类型组织细胞的不成熟细胞，是组织细胞更新换代和维系组织、器官结构与功能完整的种子细胞，可用于组织缺损和损伤修复等多种疾病的治疗。

干细胞研究中，具有里程碑意义的突破性进展主要有：①1957年 Thomas发表在 N Engl J Med上的研究结果表明，同种异体物骨髓可以重建骨髓的造血衰竭；②1981年 Evans和 Martin分别建立了小鼠胚胎干细胞系，这项成果直接导致了基因敲除技术的产生，也是再生医学理论诞生的标志；③1998年美国科学家成功培养出世界上第一株人类胚胎干细胞系，表明可将胚胎干细胞定向分化以构建组织，用来替代损伤及老化的组织或器官；④20062007年 Yamanaka和 Thomson两个研究组分别在Cel与 Science上报道，通过导入4种基因(Oct-34、Sox-2、Ki-4和c-Myc)可使皮肤细胞重编程为类ES细胞的诱导性多能干细胞(iPS细胞)，使得在不用胚胎或卵母细胞的前提下制备用于疾病研究或治疗的胚胎干细胞(ES细胞)样细胞成为可能。

西安干细胞的“干”(音gan)，译自英文“stem”，意为“树”“干”和“起源”。干细胞犹如一粒种子，可以在合适的土壤中发芽生长成参天大树，类似于一棵树干中的嫩芽，可以长出树枝、树叶，开花和结果。“干细胞”一词早在19世纪的生物学文献中就有报道，只是随着研究的深入而逐渐被人们广泛认识，并被赋予了新的内涵。1878年出现了第一篇关于哺乳动物受精卵的研究报道。1896年， Wilson在论述细胞生物学的文献中第一次应用干细胞这个名词，专门用来描述存在于寄生虫如蠕虫、线虫、蛔虫等生殖系中的未成熟祖细胞。 Boveri等学者在1897年进行线虫的研究中发现，祖细胞在经过连续卵裂之后，只有一个细胞保留了全部的染色体并包含有成体生殖细胞的全部成分，但是限于技术条件和有限资料，当时人们认为干细胞只是能够产生子代细胞的一种较原始的细胞，提不出分化和自我更新的概念。

实际上，大多数动物在出生后，成熟细胞在正常情况下难以继续分化，器官和组织在生长发育过程中伴随的只有细胞增殖和体积的增大，不再产生其他类型细胞的发育和分化，而大多是为了维持机体的平衡，但成熟细胞的增殖能力也十分有限，难以长期维系生存。例如肝脏细胞具有较强的增殖能力，部分切除肝组织的情况下可通过肝细胞增殖得到完整修复，但在部分切除肝组织的同时给予诱导性肝损伤的化学毒性物质时，肝组织则难以通过肝细胞分裂增殖的机制来修复损伤和维持功能，必须通过肝干细胞或外源性补充干细胞才能修复。在生命过程中，大多数的成体细胞都会衰老死亡，需要不断地更新换代，例如皮肤、小肠和血液细胞等每天都有部分细胞死亡和细胞新生，细胞新生的种子则是这些组织中的干细胞。成体组织中的干细胞群的生理意义是补充衰老死亡细胞，控制和维持细胞的再生，从而维系组织器官的结构与功能。若因为环境或食物残留毒性物质等因素的影响导致干细胞数量减少或活性降低，人体则可能进入衰老状态。如果只是个别组织、器官中的干细胞数量减少或活性降低，则可能岀现单个组织器官的功能减退，如果说多个组织器官中的干细胞数量减少、活性降低，则有可能出现整体功能衰退。随着科学技术的进步和实验工具的发展，人们对干细胞在组织中的分布、定位、与组织微环境的相互作用、增殖分化及调控标志分子、参与和促进损伤修复分泌功能、基因表达谱等作用及机制有了较为详细的了解，对干细胞的地位和作用的认识也逐渐深入。1983年 Sulston在文献中报道，对线虫细胞系的研究中清楚地表明生殖系祖细胞的发育潜能在每个连续的分裂过程中发生了明显的改变，结果是早期的细胞分裂的产物仍保持了有关亲代分裂球的特性，并证明具有自我更新的能力，而这一点正是目前所认为的干细胞的基本生物学特征，而非早期的细胞系的特征。此时，对干细胞才有了较全面的认识。

真正的干细胞研究始于20世纪40年代关于造血干细胞( hematopoietic stem cell，HsC)的推论，但没有它存在的直接证据，也没有用于临床治疗的理念。第二次世界大战即将结束的1945年，美国在日本的长崎、广岛投放了2颗原子弹，造成了大量电离辐射伤的伤员，经观察硏究发现，这些伤员均是因为严重的造血功能衰竭而惨死。随后，人们开始了骨髓细胞悬液输注治疗受致死剂量放射线照射伤员的研究，美国华盛顿大学的 Thomas于1956年在同卵双胞胎间进行了首次骨髓移植，用于治疗其中的一名晚期白血病患者，随后又进行了5例相同的洽疗，这些患者都先进行辐射和化疗，然后实施同卵双胞胎来源的骨髓悬液静脉输注，结果没有发生严重不良反应，但只有其中一位检测到供体来源的骨髓，没有一位生存期超过100天。1957年 Thomas在 N Engl J Med上发表了他的研究结果，认为同种异体动物骨髓可以重建骨髓的造血衰竭，提出了骨髓移植( bone marrow transplant，BM)的概念。1959年，该研究小组又对2例晚期白血病患者进行了同卵双胞胎来源的骨髓移植，发现造血功能迅速恢复，同时白血病消失，但2名患者均在6个月后复发，这次研究使 Thomas确信骨髓对患者的致死量辐射具有保护作用，而且可以缓解晚期白血病。 Thomas还在犬的骨髓移植研究中发现三个与临床移植中患者类似的感染、排异和移植物抗宿主病( graft- versus-host-disease，GVHD)问题，但他对造血干细胞移植充满信心，于是开展了攻克免疫排斥和GVHD的研究。 Thomas被认为是造血干细胞移植之父，鉴于他对造血干细胞移植治疗研究方面的杰出贡献，于1990年被授予诺贝尔生理学或医学奖。1960年前后，世界各地及中国内地均开始使用未经配型的异体骨髓移植治疗大剂量意外核辐射的患者，但没有1例取得成功，被认为是无奈之举，是白血病治疗到后的一种可怕治疗方案，原因是人们对移植免疫排斥反应一知半解，面对失败束手无策。随后，美国科学家 Cronkite等利用放射自显影技术对骨髓造血干细胞的增殖分化过程进行了研究，取得了大量的证据，提示体内有造血干细胞的存在。加拿大的T和 McCulloch于1966年报道，将同种异体的骨髓细胞悬液输入受致死剂量放射线照射的小鼠体内，这些细胞可以在脾脏内形成脾结节(集落)，进一步研究发现这种结节来源于单个细胞的克隆生长，其中包含有红细胞和粒细胞，将其移植给其他受致死剂量放射线照射的小鼠，同样还能形成脾结节，表明脾结节中仍然含有干细胞。该研究提供了干细胞具有自我更新和分化潜能的有力证据。美国华盛顿大学的 Thomas于1967年发表研究报告认为，如果将正常人的骨髓移植到患者体内，可以治疗造血功能障碍，这是干细胞临床研究的开端。因此，普遍认为，干细胞的临床应用研究是从血液系统开始。 Stephphenson于1970年报道，发现红系晚期祖细胞集落。1979年加拿大的 Fauser等先后报道在小鼠和人类粒细胞、红细胞、单核细胞及巨核细胞集落形成单位( CFUGEMM)，但他们都不知道其中不含淋巴细胞和早期祖细胞也有多向分化能力的事实。到1970年之后，许多基础研究证实了造血祖细胞的存在，推测骨髓移植重建造血功能的种子细胞其实是其中的造血干细胞，从此造血干细胞移植的理念开始得到广泛公认。 Schofield等于1978年提出骨髓基质( stroma)所构成的微环境是正常造血的必需条件，但当时对骨髓基质的结构、组成及微环境中的细胞与细胞之间的三位结构及相互关系，细胞因子的造血调控机制一无所知。因为体外培养体系难以模拟体内的造血微环境，而之后30年在攻克造血微环境方面进行了大量研究但并未取得进展。

造血干细胞技术的发展得益于分子生物学、免疫学等相关技术的发展。20世纪60年代，法国巴黎圣路易思医学院的 Dausset等在肾移植研究中发现，肾移植失败患者的血清中有针对供者白细胞表面抗原的抗体存在，后来将这种诱导产生抗体的白细胞抗原命名为人类白细胞表面抗原( luman leukocyte antigen，HLA)。进一步研究发现，HLA是体内各种组织细胞的共同的组织抗原，有不同亚型位点、基因定位及上千个等位基因，在造血干细胞移植中，如果供、受者间HA等位基因相合程度高，则有可能降低移植免疫排斥反应的程度，HLA的发现使移植技术和移植免疫学得到快速发展。1985年 Martin等证实，GVHD与于移植物中的T细胞效应有关，后来发现启动GVHD的是移植物中T细胞的一个亚群，还有一些T细胞亚群与NK细胞协同监视和移植体内残存的白血病细胞的生长，产生特异性的移植物抗白血病效应。T细胞亚群及功能多样性的发现是对造血干移植的杰出贡献。1984-1985年间，关于HA及移植免疫的研究成果曾3次获得诺贝尔生理学或医学奖。随着造血干细胞移植免疫配型、基因配型、强力免疫抑制剂的出现，造血生长因子的发现以及在造血干细胞移植中的应用，单克隆抗体、免疫细胞化学、基因结构分析等技术在白血病诊断中的应用，分子生物学技术在移植检测中的应用，造血干细胞移植成功率不断提高，该技术在20世纪80年代以来得到快速发展，成为了恶性血液病治疗的有效手段之一。美国Romeyer于1995年发现脐血内富含造血干细胞并于1997年发表了第一例脐血临床移植。1999年由纽约政府出资在该地血液中心建立了世界首个脐血干细胞库，引起了全球的高度关注，随后世界各地纷纷建立脐血干细胞库，目前已有上百家脐血干细胞库分布于世界各地，一些脐血干细胞库还实现了信息数据共享，极大地促进了造血干细胞移植技术的发展。脐血干细胞移植类似亲缘关系的骨髓造血干细胞移植，即使有1~2个HLA基因位点不完全合也可以安全植入成功，一般在5000份脐血中找到合适移植物的概率大于95%。脐血干细胞移植存在的关键问题是单份脐血的造血干细胞数量难以满足成人患者移植需要，但如果用于治疗儿童患者就没有问题，随着多份脐血联合移植治疗成人恶性血液病的研究不断取得进展，脐血造血干细胞移植治疗的应用将不断扩大。