干细胞存储——病原生物检测方法

排除 UCMSC携带病原微生物的重点环节是对产妇进行产前健康体检，干细胞存储排除携带某些特定病原微生物的可能，同时还要注意排除病原微生物潜伏期感染的可能，一般应在第1次检测后2个月再次复检。在 UCMSC于体外培养过程中和入库前，可以对培养上清或细胞裂解产物进行病原微生物检测，尽可能排除细胞产品携带病原微生物的可能。检测病原微生物的种类和方法是排除 UCMSC携带病原微生物中值得研究的问题，在排除病原微生物种类上应考虑临床常见的具有传染性的重要病原微生物，如乙型肝炎病毒、艾滋病病毒等，在检测方法上应选择灵敏度高、重复性和稳定性好、简便易行的标准化方法。未来的发展方向是采用生物芯片(基因芯片和蛋白芯片)，可以实现高通量检测，一次性排除成千上万种病原微生物。在实际操作中，为保证检测结果的准确性，应采用多种方法同时进行，同时选择权威机构和多家实验室进行检测，结果一致说明准确可靠。

从实际情况来看，能够在体外培养条件下稳定生长的细胞一般不会携带细菌类病原生物，因为一旦有细菌污染，培养体系的性质会很快发生改变而导致细胞死亡。因此，干细胞存储体外分离和传代培养出来的 UCMSC应该不会有携带细菌的可能。体外传代培养的细胞如果有真菌类病原污染，一般肉眼可见，细胞也难以稳定生长，排除方法相对简单。

关于支原体和衣原体污染问题，由于其比细菌和真菌类更微小，虽然在短时间内不会出现培养液混浊、颜色变化、絮状物等，肉眼可能难以鉴别，但污染了这类病原微生物的细胞随着培养时间的延长，培养体系中会岀现泥沙样沉积物，细胞变性、坏死、漂浮，难以在体外稳定生长。因此，大多数细菌、真菌、支原体类病原体可以从 UCMSC在体外培养条件下的生长特性、细胞形态、活性状态等方面进行判定和排除。在 UCMSC质量控制体系中，需要通过检测分析和鉴别排除的病原微生物重点是病毒类，因其属于微观粒子，可能在细胞内生长，肉眼和普通光学显微镜下难以观察到，干细胞存储只有利用电子显微镜观察、基因扩增、免疫学检测等方法才能分辨出来。排除UCMSC中的病毒，常用的方法是用标记抗体或抗原进行特异性抗原抗体反应，通过标记物分析判定样本中是否含有病毒抗原或抗体，具体包括酶联免疫吸附实验(ELSA)放射免疫测定法(RA入免疫胶体金标记技术(ICS)等。

病毒DNA检测也常用于血液样本和培养物中特定病毒的检测，其方法主要有：①设计病毒特定基因引物，采用酶联聚合反应(PCR)扩增凝胶成像观察；②用标记的DNA分子作探针，通过DNA分子杂交方法，鉴定样本中的特征性遗传信息；③基因芯片检测：该方法是根据基因探针杂交的原理，将病毒特异性核酸探针固定于基片上，通过核酸杂交反应后确定标记物的颜色强度判定样本是否含有特定病毒和病毒载量；④蛋白芯片检测：利用抗原抗体反应的原理，将标记抗原或抗体固定于基片上，通过与样品进行反应后，通过观察标记物的颜色强度判定样本是否含有特定病毒和病毒载量。利用免疫电镜技术可以对细胞内病毒进显色、定位和判定病毒载量，该技术是将免疫化学技术与电镜技术相结合，在超微结构水平观察抗原、抗体结合定位，主要有免疫胶体金技术、免疫酶标技术、免疫铁蛋白技术等。

排除体外制备的 UCMSO的病原，主要参考临床输血的病原检测方法和标准，重点检测病原体包括：艾滋病病毒(HV)、乙型肝炎病毒(HBV)丙型肝炎(HCV)鼻炎癌病毒(EBV)巨细胞病毒(CMV)及梅毒螺旋体( treponemapallidum)等。为排除携带病毒的潜伏期，应在产前、产后60天分别采集妊娠妇女外周血进行上述病原检测，如果产后60天采血难以实现，也可在产前增加采血量，留取部分样本置于4℃条件下放置60天后检测。UCMC人库前可再次复检，干细胞存储方法是采用超声破碎法或反复冻融法破碎细胞，离心获取上清液，采用DNA测定法或 ELISA法检测上清液中是否含有病原体抗原。