脐带间充质干细胞冻存和复苏的要求及注意事项【免疫细胞存储】

1.体外培养的脐带间充质干细胞对EDTA-0.25%胰酶消化比较敏感，胰蛋白酶的最佳活性温度是37℃，消化时间3~5分钟，消化过程中应注意控制消化酶作用的时间和温度，消化3分钟后应密切观察细胞形态和脱落状况，免疫细胞存储避免消化过头而导致细胞活性降低。一旦发现细胞收缩成圆形和晃动培养瓶有大量片状细胞脱落时，应立即加入含20%血清的培养基终止消化，如果还有部分细胞贴壁，可采用吹打和敲击瓶底的办法使细胞脱落。如果还有部分细胞难以脱落的话，可先吸岀脱落细胞后再加少量消化液继续消化或直接加入培养基继续培养。

2.冻存细胞的离心洗涤过程也是影响细胞活性的重要因素，应尽量减少机械性损伤的可能因素，离心转速和时间应针对不同实验条件和不同的离心机摸索确定，以达到沉淀细胞为准，不宜转速过高和离心时间过长，本实验室采用的离心参数是400g离心10分钟，洗涤次数不超过3次，一般2次即可。

3.冻存液对脐带间充质干细胞的活性有一定影响，关键环节是冻存液的成分和质量、冻存降温和复苏过程及操作过程中对细胞的损害。脐带间充质干细胞保存液通常是在DMEM/F12完全培养基的基础上添加5%~10%的DMSO、2%白蛋白，加入SCF、 bFGF EGF等细胞因子有利于维持细胞活性，冻存管的细胞悬液不宜装入过多，以免冻、融过程中膨胀后裂损而导致污染。

4.操作过程中应特别注意注明和核对标签，确保冻存细胞的编号或标识前后一致。

5.人库或提供临床使用的脐带间充质干细胞制剂必须无菌分装，分装容器必须无毒性、无污染，标明名称、体积、数量、活性、批号、制备人等，同时留样长期储存被査，所有技术资料应完整和可溯源。

6.有条件的细胞制备实验室，应建立细胞制备过程物联网管理信息系统，实行全过程监督管理和信息资料可视化，尽可能避免差错、遗漏。

7.复苏时应从液氮中取出装有细胞的冻存管后，立即置于40℃温水中并注意晃荡使其快速融化，融化过程中应保持适当距离，防止冻存管爆炸伤害眼睛等。融化后应用酒精棉球擦拭干净冻存管，避免开盖时外源水或杂质进入。融化后应立即进入洗涤程序，尽量减少干扰因素。

8.细胞接种密度影响传代扩增的培养实践，免疫细胞存储采用1:3的比例，即相同面积的培养瓶以1瓶细胞传为3瓶较为合适。静置培养过程中应尽量不要晃动培养瓶，每次观察细胞应小心轻放，注意观察培养液的颜色变化和pH值改变，发现培养液变黄应及时换液，一般3天左右换1次。