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密度梯度法是在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13~1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，免疫细胞存储但步骤烦琐，耗时，对离心时间极为敏感。和超高速离心一样，密度梯度法所有步骤都要在4℃完成。具体操作步骤如下：
1.按照前述超高速离心法步骤获得初步纯化的外泌体沉淀。
2.用25mPBS重悬外泌体沉淀。
3.制作垫子小心加入4 maTris/sucrose/2O溶液到SW28管底部。免疫细胞存储
4.小心加入外泌体悬液到已经铺有垫子的SW28管液体表面，注意不要破坏垫子表面。1000009g,4℃,离心75分钟。
5.用5m填充有18-G针的注射器，沿着离心管壁深入垫子，收集3.5ml包含外泌体的Tris/ sucrose/2O溶液。
6.将上述35ml溶液转移到新的离心管中，加入60mPBS洗涤。采用45转头,10000×g，4℃，离心70分钟，去上清，保留沉淀
7.用50~100μuPBS重悬沉淀，免疫细胞存储所得沉淀即为与超速离心法相比纯度更高的外泌体。
