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【造血干细胞存储】外泌体分离方法—— PEG沉淀法

2023-08-02 14:58:56

 PEG沉淀法

聚乙二醇(PEG)为常用的多聚物,可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀,早先应用于从血清等样本中收集病毒,现在也被用来沉淀外泌体,其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题:比如纯度和回收率低,杂蛋白较多(假阳性)颗粒大小不均一,产生难以去除的聚合物,造血干细胞存储机械力或者 Tween-20等化学添加物将会破坏外泌体等,影响实验结果。

此处以某公司的产品为例,对其操作流程进行一个简单介绍:

实验前准备:由于FBS中含有丰富的外泌体,这将会给后续实验带来很大的污染,因此用48小时饥饿后的培养基上清,玻璃管,4℃,离心机,0.22um一次性滤器。

注意:饥饿细胞前要保证细胞状态良好,细胞状态直接关系到外泌体的产量。

1.收集4ml细胞培养上清。

2.3000×g,15分钟4℃离心或者0.22μm滤器过滤。

3.配制反应混合液(A:0.25mlB:0.25mlClml)造血干细胞存储按照ABC的顺序加,将混合物剧烈震荡10秒后立即加入上一步准备的培养基上清中;注:使用玻璃管而不是塑料管。

4.剧烈震荡30秒之后冰上静置30分钟。

5.分层后快速去除顶层和底层,将云雾状层立刻转移到1.5mlEP管中,离心5000×g3分钟;其中顶层保留作为实验对照。

6.再次分层后去除顶层和底层,将云雾状层立刻转移到05mEP管中,离心5000×g3分钟。

7.再次去除顶层和底层,开盖挥发10分钟;但不要让沉淀完全干燥。

8.加入4倍沉淀体积的1×PBS造血干细胞存储用枪尖上下混匀40-60次后放在水平震荡仪上高速震荡10分钟,间隔3分钟上下吹吸40这一步非常关键,外泌体可能被包裹在沉淀中难以重悬,造成结果的产量低

9.5000×g,5分钟离心,上清过柱,沉淀4℃保留。

10.1000×g,10分钟,收集过柱后的液体即为产物。

造血干细胞存储

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