【西安干细胞公司】外泌体分离方法——色谱法

色谱法

色谱法是利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。样品中大分子不能进入凝胶孔，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被流动相洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强地滞留，更慢地被洗脱出。分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。目前，根据此原理也有一些商品化的试剂盒出现，代表性产品为Lzon公司开发的qEⅤ柱。其优势在于分离时间仅为15分钟，西安干细胞公司所需要的样本量少，极大程度降低蛋白复合物产生和囊泡聚集的风险，不会破坏外泌体的生物学活性和结构，因此有越来越多的研究者采用该方法分离外泌体。

其操作流程如下:

1.安全预防

(1)当使用qEV柱时采取适当的个人防护措施，比如实验服，手套和防护镜。

(2)柱子的抗菌溶液包含0.05%w/v的叠氮化钠。大量的叠氮化钠有毒，所以应该避免皮肤和眼睛的直接接触。

(3)废弃缓冲液应妥善处理：叠氮化钠会在铜制管道中累积引起爆炸。生物样品可能有危险，当使用qEV柱时，请教实验室安全员有关样品安全操作的要点。

2.保存柱子保存在含有抑菌剂，例如20%乙醇，或<0.05%w/v的叠氮化钠)的溶液中，存放于4-8℃。抑菌剂可以在冲洗步骤时引入。使用前将柱子固定，使液面水平，确保柱子垂直，不要移除底部滑动盖，西安干细胞公司小心缓慢地移去顶盖。

3.平衡柱子

(1)移除底部滑动盖，并且使用至少10m洗脱缓冲液(PBS)冲洗柱子。如果不是使用PBS洗脱，那么至少使用30m洗脱缓冲液冲洗柱子。记下5ml缓冲液通过尺寸排阻柱通过的时间，这可用于判断何时需要清洗柱子。

(2)确认有充分的平衡时间使柱子温度介于操作温度范围内。

(3)不要使柱子变干。顶部的筛板必须保持湿润。柱子变干会影响其功能。

(4)使用当天新配的过滤(02um)缓冲液避免引入颗粒物污染。

     4.样品的纯化

(1)在柱子移除底部滑动盖之前，用移液枪移除筛板顶部的缓冲液。

(2)加入500样品。

(3)立即移去底部滑动盖。

(4)立即开始收集0.5ml馏分；开始的六个馏分(3.0ml)是空隙体积，不包含囊泡，通常无需分析。建议将空隙体积收集在同一个收集管中来节约时间，并可避免6个单独的管子带来的测量误差。

(5)当样品刚刚进入柱子顶部筛板(与之相平)，加入更多的缓冲液，西安干细胞公司但是不要高于顶部筛板2ml。等待直到后一滴样品刚刚进入柱子顶部筛板，避免样品稀释。

(6)空隙体积之后立即收集3个囊泡馏分，每个馏分500u(馏分7、8和9)。测量每个馏分的EV浓度(使用 Izonq Nano)和蛋白纯度。为了得到高浓度囊泡，使用高EV浓度的馏分(通常7和8)。注意：合并馏分会稀释EV浓度。为了得到高纯度囊泡，使用低蛋白浓度的馏分。

(7)当收集完囊泡馏分之后，用至少10m缓冲液冲洗柱子，并按照要求保存柱子。记下5ml缓冲液通过排阻柱所需要的时间，这对于检测何时清洗柱子很有用。流速的改变可能暗示柱子被堵住或被污染。