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【造血干细胞存储】脐带间充质干细胞的原代培养

2023-09-25 14:37:18


1.在无菌条件下取脐带一根,转移入50ml离心管中加入生理盐水反复冲洗3遍以上,最后用双抗水浸泡5~10分钟,用生理盐水冲洗干净后,在无菌的培养皿中,用镊子配合剪刀去除被膜、血管等,再用生理盐水冲洗去除血液和杂质。如果是制备临床应用细胞,必须是取自检査合格的脐带,最低检测标准至少应符合临床输血要求,HV、HBV、HCV、梅毒、CMV检测为阴性的健康产妇。

2.用高压灭菌过的眼科虹膜剪将组织分离为0.5cm长的组织块若干,造血干细胞存储再将组织块转移至一个1.5mlEP管内,用虹膜剪将EP管内的组织剪碎至糊状,一般使组织块在1mm3以下。

3.加入等量DMEM/F12基础培养基,直接将EP管内的糊状组织接种于培养瓶中一个EP管对应一个T175的培养瓶,然后加入10ml已调整好pH值的含10%FBS的完全DMEM-F2培养液,轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部,然后放入5%CO237℃、饱和湿度的培养箱中静置于贴壁培养,期间避免振荡,目的是使富含间充质干细胞的组织充分贴壁。

4.静置培养24小时后,在倒置显微镜下观察,组织块贴壁牢固后,可补加完全培养基10~15m之后3-4天换1次培养液,静置培养7~9天后,可见大量细胞贴壁。此时,用吸管

轻轻吸出一半培养液,轻轻摇晃培养瓶,使组织块脱离瓶底,吸弃上清和悬浮组织块并接种于新培养瓶中加入新鲜10%FBS的完全 DMEM/F12培养液继续进行贴壁培养,密切观察细胞生长情况,依据细胞生长情况每隔3~4天换液1次。

5.第1次贴壁培养成功并更换培养液时,可用吸管反复吹打,使微组织快脱落,再将脱落下来的组织块接种至相冋面积的另一塑料培养瓶的瓶底进行贴壁培养。造血干细胞存储同一脐带组织块至少可反复进行3次重复贴壁培养,即可获得常规培养3倍数量以上的原代UCMSO。

6.脐带组织块培养后2周左右,细胞可长满瓶底,达到80%以上融合,此时可用吸除培养基,加入适量0.25%的胰酶,充分摇晃均匀,置于37℃培养箱中放置5分钟,注意观察细胞形态变化,发现细胞收缩,摇晃培养瓶有片状细胞脱落时,立即加入含10%血清的培养液10~-15m终止反应,用吸管吹打使细胞完全脱落,然后将细胞悬液移入离心管中300~400×g离心10分钟,再加入生理盐水10m,离心洗涤,反复3次后,计数活细胞,用完全培养基稀释,收集细胞进行冻存或继续传代培养。传代培养的过程是纯化间充质干细胞的过程。

7.传代培养通常采用专用细胞培养瓶,以 DMEM/F12培养基为基础,按原代培养密度1:3的比例进行传代培养。作者所在实验室创建了一种以脐带组织块培养法为基础的高效、大规模体外制备技术,组织块可反复接种培养3次以上,获得原代细胞的数量在1×10个细胞以上,传代培养至第3代,可获得36×100个细胞。

8.长期在体外传代培养的是否会衰老、突变等一直是人们关注的问题,也是影响细胞质量的深层次问题。国外对骨髓间充质干细胞体外长期培养研究发现:如果在体外连续传代培养60次以后就会观察到间充质干细胞衰老和自动向脂肪细胞分化。笔者长期培养实验证明:在体外传代培养8次以内的脐带间充质干细胞安全性和活性是有保证的。连续传代8次以后,个别细胞会发生染色体变异。

造血干细胞存储

除了上述组织贴块法分离培养脐带间充质干细胞之外,还可以采用胶原酶、造血干细胞存储胰酶混合消化法制备脐带间充质干细胞:胶原酶消化法是组织块贴壁法的延伸方法,起初步骤与组织块贴壁法相同,只是脐带剪成1mm3大小的组织块后将组织块转入1g/L的胶原酶Ⅳ中,37℃孵育搅拌消化30分钟后,随即用1g的胰酶消化30分钟,再用完全培养基终止消化,经200目筛网过滤消化液,离心弃上清,生理盐水洗涤2次,调整细胞接种密度为1×105个/ml接种到含 DMEMF2培养基的T175塑料培养瓶中,5%C0237℃静置培养48小时后换液,除去未贴壁的细胞,原代呈梭形、纤维样细胞,3-4天细胞可克隆样生长,5-6天后细胞传代逐渐融合达70%-80%时呈匀质、涡旋状排列生长。

酶消化法和组织贴块法是分离培养 UCMSC两种基本方法,但酶消化法存在酶的浓度和消化时间控制不好就可能会损伤细胞膜、降低细胞活性甚至改变细胞功能,而且操作烦琐,这不符合组织培养的基本原则,因为操作越烦琐,污染的机会就越多,细胞突变的概率也越大。从简单、方便的组织培养原则出发,组织贴块法优点更多:①方法简单:直接剪碎脐带为糊状直接培养,操作步骤少,大大缩短了实验室处理的时间,而且分离方法容易标准化;②经济实用:分离培养 UCMSC的过程中不使用胶原酶,分离成本低;③安全性好:与所有干细胞一样,如何防范 UCMSC在分离培养过程中的污染和变异一直是人们关注的一个重点怎样才能最大限度地降低干细胞污染和变异的风险呢?尽量减少对干细胞的干预处理就是

最大限度地降低干细胞污染和变异的根本方法,比如简化体外分离操作环节,就可大大降低污染的概率,比如减少各种“外来物质”的接触,这也是《人的体细胞治疗申报临床试验指导原则》的基本要求—尽量避免异体血清、细胞因子、抗生素等“外来物质”的使用,当然酶消化法中常用的各种酶也属于“外来物质”的范畴,减少这些“外来物质”的使用和接触,既可降低细胞变异的概率,又可有效防止各种病原微生物的传播。


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