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【西安脐带干细胞存储】人脐带间充质干细胞的冻存

2023-10-08 09:25:26


继续进行传代培养的细胞可用完全培养基稀释后接种于新培养瓶中进行扩增培养,用于储存的 UCMSC需添加冻存液后保存备用。为维持细胞的活性,长期低温冻存 UCMSC时,冻存液需要在完全培养基的基础上添加保护剂。常用的细胞渗透保护剂有甘油、二甲基亚砜(DMS0)、甲醇、乙二醇、丙二醇、乙酰胺等,渗透性冷冻保护剂可在细胞悬液冻结凝固之前,渗透到细胞内,维持冻存过程中的细胞内外电解质平衡,保护细胞免受高浓度电解质的损伤,使细胞内的水分不会过分外渗,从而使细胞内外的渗透压基本一致。西安脐带干细胞存储本实验室使用的间充质干细胞冻存液是在完全培养基( DMEMF12培养基、25%胎牛血清、SCF50ngml、FGF50ng/ml、bFGF50ng/ml)的基础上添加2%人血白蛋白、10%二甲基亚砜作为细胞保护剂,方法是用该冻存液将细胞稀释成5×10°细胞/ml的密度,分装于冻存管中,贴上标签,置于程序降温仪中,渐进降温,最终于-196℃的液氮中长期冻存。用于临床治疔的脐带间充质干细胞可用含2%人血白蛋白的复方电解质平衡液1ml稀释,计数细胞密度和活细胞比例后,继续稀释成(1~3)×10°细胞/m,分装于专用塑料输血袋中,标签注明细胞类型、数量、体积、密度、批号、制备人等基本信息,传递出实验室备用。 UCMSC冻存操作步骤如下:

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(1)向离心洗涤后的 UCMSC加入冻存液,轻轻震荡或吹打使细胞混匀,计数活细胞数量及计算密度。

(2)用冻存液稀释成5×10°个细胞/ml。

(3)将细胞悬液分装于2ml体积的专用冻存管内,细胞悬液的分装体积按冻存管容量的2乃3计量,不宜加满,以免膨胀爆裂,然后拧紧瓶盖,贴上标签,标明细胞名称、代数、密度批号、制备人、制备日期等信息。

(4)遵循“慢冻快融”的原则,将装有(1~3)×10°细胞/ml的冻存管置于程序降温系统中,降温速度1-2℃/min,当温度低于-25℃后,降温速度可加快至5-10℃/min,当温度下降至低于-80℃后,西安脐带干细胞存储直接进入液氮中长期储存。程序降温系统是在液氮冻存灌的基础上设计安装了自动降温控制系统,按操作要求放置冻存管后即可自动降温。

(5)对于没有自动降温控制系统的 UCMSC冻存,可将冻存管放入普通冰箱的4℃冷藏室中静置30分钟,然后转移到冷冻室(-10-20℃)中放置1-2小时,再转移至超低温冰箱(-70~80℃)中放置过夜,最后将冻存管放入液氮中保存。如果没有超低温冰箱的话,可将冷冻室(-10-20℃)中放置后的冻存管置于液氮罐的液氮上方的入口附近过夜后再置于液氮中。

UCMSC可在-70-80℃条件下储存3-6个月无明显活性下降,但长期储存必须置于液氮中。冻存剂中的DMsO不能防止细胞内的水分结冰,因此需要一定时间的预冷,使其进入细胞内并在细胞内外达到平衡,以起到充分的保护作用。配制DMSO时,应使用临床级DMSO,西安脐带干细胞存储采用过滤法除菌,不能采用高压灭菌法,因为DMSO本身具有一定的杀菌作用,高压灭菌会破坏其分子结构,导致冷冻保护效果降低。DMSO在低温条件能够保护细胞并且毒性较低,但在常温条件下则对细胞有一定毒性作用,操作中应注意戴手套防护。在冻存UCMSC的过程中,特别是人站在液氮储存系统附近操作时应戴手套、眼镜、穿工作服,动作要轻,小心液氮溅出造成冻伤。


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