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【西安脐带干细胞存储】脐带间充质干细胞的复苏

2023-10-16 11:58:34


UCMSO的复苏应以很快的速度升温,在1-2分钟内达到恢复到常温水平,防止细胞内形成冰结和高浓度电解质而对细胞造成损伤。由于DMSO在常温下对细胞有一定毒性作用,复温后的细胞悬液立即处理,通过离心洗涤尽快去除DMSO。冷冻保护的效果与冷冻速度冷冻温度和复苏温度有密切关系,西安脐带干细胞存储只要操作得当,复苏后的 UCMSC仍然保持其正常的结构与功能,体外生长特性不发生明显改变。 UCMSC的复苏方法如下:

1.在实验内预先准备40℃水浴(用100ml塑料烧杯装40℃温水50m1)镊子(用于转移冻存管)、loml离心管、0.9%的生理盐水、DMEM/F12培养基、胎牛血清或人脐血血清、SCF、EGF、bFGF、吸管、移液管、一次性吸头、培养瓶等。

2.从液氮中取出装有细胞的冻存管,立即放入温水中,轻轻摇晃使冻结细胞在2分钟左右融化。为保证细胞的活性,可将冻存管置于-80℃冰箱中放置30分钟,使液氮蒸发后再转入温水中,同时避免冻存管爆裂危险。

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3.将融化后的细胞迅速转移至超净工作台,西安脐带干细胞存储用酒精棉球将冻存管擦拭干净,用吸管将细胞悬液转移到离心管中,加入5ml预热至37℃的培养液,加入1ml培养液至冻存管中冲洗管壁并转移至离心管中,反复冲洗2次,轻轻振荡混匀试管内的细胞悬浮液。

4.300g离心10分钟,用吸管去除上清,加入3m完全培养基,轻轻震荡或吹打使细胞重悬混均匀。

5.计数活细胞数量和比例,将细胞悬液接种于T75塑料培养瓶中,加入20ml完全培养基。

6.摇晃培养瓶使细胞均匀分布于瓶底,将细胞置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。

7.每3天观察细胞生长情况并换液,也可在第2天细胞贴壁后换1次液,好处是可以去除死细胞及其对正常细胞的影响。待细胞生长至80%~90%融合时收集细胞,西安脐带干细胞存储按常规弃培养上清,用平衡液或生理盐水洗涤,胰酶消化,离心洗涤,计数活细胞,用完全培养基稀释,按1:3的比例接种于新培养瓶中进行传代培养,收集1瓶 UCMSC后,接种于3个相同面积的新培养瓶。

8.传代培养后的 UCMSC生长速度远快于原代 UCMSO,一般45天即可达到80%~90%的细胞融合度,此时可继续收集继续传代培养或冻存。


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