【造血干细胞存储】UCMSO病原微生物排除的基本技术和标准——HCV定量检测

1.原理利用实时荧光PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，用于血浆标本中HCV的定性检测。另外，试剂盒还带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。使用试剂盒提供的核酸提取试剂对临床样本进行处理和核酸提取，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配置成PCR反应管，将提取后的核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行一步法PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT值)实现对未知样本的定性检测。

2.性能参数最低检出限浓度500U/ml，线性范围1000-1×10IU/ml。

3.标本要求

(1)标本类型：细胞培养上清液。

(2)标本储存和运输：室温放置不超过8小时,48℃不超过72小时，造血干细胞存储-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。

4.容器和添加剂类型无菌离心管和无菌真空管。

5.所需设备ViA7DX型核酸扩增荧光检测仪、混匀器、冰箱(4℃、-20℃)生物安全柜、紫外灯。

6.试剂离心柱(20个/包)1包、收集管(80个/包)1包、裂解液(44m/瓶)1瓶、抑制物去除液(7ml瓶)1瓶、去离子液(44m瓶)1瓶、洗脱液(3m/瓶)1瓶、蛋白酶K(22mg/瓶)1瓶、 Carrier RNA(15g/管)1管、HCV内标溶液(100山/管)1管、HCV反应液A(27o/管)1管、HCV反应液B(30μ/管)1管、阴性质控品(200u/管)1管、HCV强阳性质控品(200山/管)1管、HCV临界阳性质控品(200μ/管)1管。

7.程序步骤

(1)实验前准备:

1)抑制物去除液(浓缩液)中加人4.3ml的无水乙醇，并在管盖及管壁上打勾，室温保存。

2)去离子液(浓缩液)中加入17.6m的无水乙醇，并在管盖及管壁上打勾，室温保存。

3)蛋白酶K(干粉)中加入1.lml的洗脱液，充分混匀，溶解。-20℃保存。

4) Carrier RNa(干粉)中加入110ul的洗脱液或内标溶液(PCR试剂盒中成分)，充分混匀，溶解，-20℃保存。( Carrier rna为白色或半透明物质，仔细检查，确保其完全溶解)。

5)进行实验前须将裂解液与 Carrier rna进行混合(现配现用)，造血干细胞存储配置成裂解工作液。

(2)核酸提取(样本制备区)：将待测样本与阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品进行同步处理。

1)在1.5ml的无菌离心管内加入50u的蛋白酶K。

2)取200l样品加入离心管中。

3)再加入200u的裂解工作液(即已含 Carrier RNA的裂解液)，盖紧管盖，漩涡震荡15秒以充分混匀，高速离心10秒(防止温育时产生气泡),72℃10分钟，同时可将洗脱液置于72℃预热。

4)加入250乙醇，盖紧管盖漩涡震荡15秒。

5)将混合液全部吸至离心柱，室温下12000pm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。

6)将500u的抑制物去除液加入离心柱，室温下12000m离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。

7)将500u的去离子液加入离心柱，室温下12000pm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。

8)再次将500u的去离子液加入离心柱，室温下12000pm离心1分钟，将离心柱装至新的收集。

9)将离心柱-收集管于室温下1400pm离心3分钟以去除残余的乙醇。

10)将离心柱取出，放置于新的1.5ml离心管，打开离心柱盖子,72℃预热的洗脱液50u，盖紧管盖，室温静置1分钟后,14000pm离心1分钟，离心管内即为核酸溶液，建议立即使用,如需保存,置于-20℃。

(3)加样(样本制备区)：往上述HCV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HCV阴性质控品、HCⅤ强阳性质控品、HCV临界阳性质控品和直接加入HCV阳性定量参考品20μl。盖紧管盖,8000pm离心数秒后转移至扩增检测区。

(4)PCR扩增(扩增和产物分析区)：

1)将反应管放入仪器样品槽内。

2)ABVi7仪器设置：造血干细胞存储①打开“Seup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控(NTC、阳性质控以及未知样本( Unknow)阳性定量参考品( Standard)，并在“ Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为： Reporter Dyel：FAM， Quencher Dyel： TAMRA， ReporterDve2:VIC, Quencher Dye2:none, Passive reference:NONE。②打开 instrument窗口,设置循环条件如下:50℃15分钟,1个循环；95℃5分钟,1个循环；94℃15秒→55℃45秒(收集荧光),45个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。

8.结果分析反应结東后自动保存结果，根据分析后图像调节基线的起始值、终止值以及阈值(用户可根据实际情况自行调整，起始值可以在3-15、终止值可设在5~20，在Log图谱窗口设置阈值的 Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线，点击“ Analysis HCV"，自动获得分析结果，在 Report界面察看结果，记录未知样本数值(C)。

9.质量控制

(1)阴性质控品：FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VC检测通路扩增曲线为对数增长期。

(2)HCV阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S形扩增曲线，且强阳性和临界阳性质控品的定值分别在80×10-2.0×10Um、80×103-2.0×10Uhml。

10.结果判断

(1)如果FAM检测通道无对数增长期，且在ⅥC检测通道有对数增长期，则判样品的HCV RNA浓度小于检测灵敏度。

(2)如果FAM荧光信号增幅明显，扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S形曲线，且CT值≤36则按以下方法判断:

1)若样品的C<1.00E+003，则该样品的 HCV RNA浓度<1×101U/ml；如有扩增曲线，建议2个月以后复查。

2）若样品的 1.00E+003≤C≤ 1.00E+008,则该样品的 HCV RNA 浓度=C IU/ml。

3）若样品的 C>1.00E+008,则该样品的 HCV RNA浓度>1×10*TU/ml。如果需要精确定量结果,可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的 HCV RNA浓度=(C× 稀释倍数)IUml。

11.支持性文件《丙型肝炎(HCV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒说明书》《ABVi7 型核酸扩增荧光检测仪操作程序》。