【造血干细胞存储】UCMSO病原微生物排除的基本技术和标准——EBV 定量监测

1.原理试剂盒用—对 EDB 病毒(EBV)特异性引物和一条 EB 病毒(EBV)特异性荧光探针,配以 PCR 反应液、耐热 DNA 聚合酶(Taq 酶),核苷酸单体(dNTPs)等成分,用 PCR体外扩增检测 EB 病毒(EBV)DNA。

2.性能参数最低检出限浓度 5 ×10°基因拷贝 /ml,线性范围 5×10°~5×10°基因拷贝/ml。

3.标本要求

(1）标本类型:脐带间充质干细胞悬液。

(2)标本保存和运输:标本可立即用于测试,也可以保存于-20℃待检,保存期为6个月,标本运送采用0℃冰盒。

4.所需设备 ViiA7 DX 型核酸扩增荧光检测仪、造血干细胞存储混匀器、冰箱、生物安全柜、紫外灯。

5.试剂 DNA 提取液( 500μ/ 管)、PCR 反应管、阴性质控品(150μl/管)1 管、临界阳性质控品（200μ/ 管）、强阳性质控品(200μl/管)、EBV 阳性定量标准品(1×10*-1×10°基因拷贝/ml, 10μl/ 管)4 管。

6.程序步骤

（1）DNA 提取：阴性质控品处理：

1）取出阴性质控品,8000rpm 离心数秒,吸 50μl 至 0.5ml 灭菌离心管中,加入 50μDNA提取液充分混匀,100℃恒温处理(10±1)分钟。

2）12 000mpm 离心 5 分钟,备用。

（2）标本处理：

1)取全血 1ml 至干燥玻璃管试管中,加入生理盐水 1ml 轻摇混匀。

2）取干燥玻璃管试管加入 500μl淋巴细胞分离液。

3）将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁,速度要慢）。

4）2000mpm 离心 20 分钟(建议用水平离心机)。

5）吸取白细胞层(从上往下的第二层),加入 1.5ml 离心管,12 000rpm 离心 5 分钟。

6)弃上清,沉淀中加入 50μDNA 提取液充分混匀,100℃恒温处理(10±1)分钟。

7) 12 000rpm 离心 5 分钟,备用。

（3）EBV 临界阳性质控品处理(同阴性质控品）。

(4）EBV 强阳性质控品处理(同阴性质控品）。

(5） EBV 阳性定量参考品处理:8000rpm 离心数秒,备用。

（6）PCR 扩增：

1)加样:①单管单人份:取 PCR 反应管若干,造血干细胞存储加入处理后的样品(标本,阴性质控品、临界或强阳性质控品)上清液2u或阳性定量参考品2ul,8000pm离心数秒，放入仪器样品槽。②大包装：按比例( EBV PCR反应液40人份)取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43u/管分装至02ml离心管中，备用。向准备好试剂的02ml离心管中，分别加人处理后的样品(标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品)上清液2μ或阳性定量参考品2μul,800opm离心数秒，放入仪器样品槽。

2)编辑：①按对应顺序设置阴性质控品，阳性定量参考品及未知标本(含临界、强阳性质控品)，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，点击工具栏P键，选择 PRI Primer后关闭窗口。选择工具栏中Q键，输入对应阳性定量参考品浓度。②打开 Instrument窗口设置循环条件:93℃2分钟,93℃45秒→55℃60秒→10个循环,93℃30秒→55℃45秒→30个循环。保存文件，运行。

3)结果分析：①反应结束后保存检测数据文件。②分析条件设置：根据分析后图像调节 Basement的stat值、stop值以及 Threshold的 Value值(可根据试剂情况自行调整，start值可以在1~10、stop值可以在5~20、 Value值可以在0.01~0.2范围选择)，使 Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即 correlation数值介于-1.0~-0.97，在 Analisis菜单下选择Analyze自动分析结果。③到Tray窗口，记录未知标本数值。④记录 Calculated concentration下面一起自动分析计算出的未知标本数值(C)。

7.质量控制

(1)阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或CT值=30。

(2)阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考值在6.310×10~1.000×103基因拷贝/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在6.310×103~1.000×103基因拷贝/ml范围。

(3)阳性定量参考品，增长曲线呈S形，CT值<27。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新检测。

8.结果判定

(1)阴性结果判定：如果增长曲线不呈S形曲线或CT值=30，造血干细胞存储则实验结果判为样品的EBV DNA含量小于检测极限。如有扩增曲线，建议2个月以后复查。

(2)阳性结果判定：如果增长曲线呈S形曲线且CT值<30，则实验结果按以下方法判断：①若样品的C<500E+003，则全血样品 EBV DNA总含量<5.0×103基因拷贝/m；②若样品的500E+003≤C≤500E+007，则全血样品 EBV DNA总含量=C基因拷贝/ml；③若样品的C>500E+007，则全血样品 EBV DNA总含量>5.0×10基因拷贝/ml。

9.支持性文件《广州达安EB病毒荧光定量检测试剂盒说明书》《 ABI ViL7荧光定量PCR仪标准操作及维护程序》。