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1.原理本品选取人巨细胞病毒株(即人疱疹病毒5型)-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的E1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp，利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。
2.性能参数最低检出限浓度为10 copies/ml。
3.标本要求
(1)标本类型：细胞培养上清液。
(2)标本储存和运输：室温放置不超过8小时,48℃不超过72小时，造血干细胞存储-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。
4.所需设备 ABI PRISM7000荧光定量PCR仪、台式高速离心机、混匀器、冰箱(4℃、-20℃)生物安全柜、紫外灯。
5.试剂DNA提取液(500管)2管、CMV-PCR反应管20管、阳性定量参考品(2osol)(50u/管)1管、弱阳性质控品(200管)1管、强阳性质控品(200uy管)1管、阴性质控品(50/管)1管、稀释液(500/管)1管。
6.程序步骤
(1)样本制备(在样本制备区操作)
1)血清处理：吸取上清(注意勿细胞)至无菌1.5 ml append管，即为血清标本。取50血清加50uDNA提取液打匀,100℃保温10分钟,1200pm离心5分钟，取上清液(含病毒DNA)5μ做PCR扩增。
2)阴阳质控品处理：质控品加50uDNA提取液打匀。100℃保温10分钟(误差不超过1分钟),2000pm离心5分钟，取上清液5μl做PCR扩增。
3)参考品稀释和处理：将阳性定量参考品(2×10 copies/ml)600m0n离心数秒标示为10另取4支灭菌新05ml离心管，分别加入90u稀释液，依次标示为107-10。吸取10管1ou至10管，用加样器反复混匀后换新吸头取10ou至10管，依此方法依次稀释至10管。-20℃保存；吸取5个(2×103-2×10 copies/ml)的阳性定量参考品梯度和阴性质控品各40ul，分别加40μDNA提取液打匀，以下步骤同样本处理。造血干细胞存储上清液(含病毒DNA)待用于PCR扩增。
(2)PCR扩增(在扩增区操作)：取CMV-PCR反应管若干，分别加入处理后上清液(含病毒DNA)各5μ,6000m离心1分钟。将各反应管放入定量PCR仪器的孔样品槽内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量质控参考品梯度(应设置为10-10 copies/m1)以及未知标本，并设置样品名称标记荧光基团种类和循环条件:93℃→2分钟预变性，然后按93℃45秒→5℃60秒，先做10个循环，最后按93℃30秒→55℃45秒，做30个循环。
(3)结果分析：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节Baseline的stat值(2~4)，stop值(7-9)以及 Threshold值，使 Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳( correlation数值介于-0.97~-1之间， correlation数值等同于r值，最后到 Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值(Qty)。
(4)质量控制:
1)阴性质控品:全部阴性。
2)阳性定量参考品：全部阳性lr≥0.97( correlation数值等同于r值)。
3)弱阳性质控品数值范围:2.5×104-4×10°拷贝/ml。
4)强阳性质控品数值范围:25×10-4.×107拷贝/ml。
以上要求需在同一次试验中同时满足。否则，本次试验无效，造血干细胞存储全部试验应重新进行。
(5)结果判断:
1)阴性结果判定：如果增长曲线不是典型的S形曲线或CT值=30，则实验结果判为小于10copies/ml。
2)阳性结果判定与计算：如果增长曲线呈典型的S形曲线且CT值<27，则实验结果判为阳性。样品的 HCMV DNA含量( copies/ml)=Qy/20。若样品为血清，则样品中的CMVDNA含量( copies/ml)=Qty。
7.支持性文件《人巨细胞病毒核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》 ABI PRISM7000荧光定量PCR检测仪操作程序》。
