【造血干细胞存储】脐带间充质干细胞生长特性及形态特征鉴定

脐带间充质干细胞的鉴定，根据国际细胞治疗协会提出的“间充质干细胞的标准”，从脐带分离获得的细胞是不是间充质干细胞，必须从细胞生长特性、形态学特征、免疫表型标志、分化潜能甚至生物学功能等诸多方面检测鉴定。

脐带间充质干细胞生长特性及形态特征鉴定

(一)脐带间充质干细胞的生长特性检测

1.原理运用改良的MT法，通过比色来检测脐带间充质干细胞的活性，造血干细胞存储并绘制生长曲线，计算出群体倍增时间。

2.试剂和仪器MTX检测试剂盒、96孔组织板、酶标仪。

3.步骤取对数生长期的脐带间充质干细胞，胰酶消化成单细胞悬液，PBS离心洗涤三遍后，计数，按照2×10}孔接种96孔板,100山/孔，置于5%CO2、37℃的培养箱中静置培养。每隔24小时，每孔加入20μMTS孵育2小时后，用酶标仪(490m)测定各孔吸光度值，连续观察10天后，以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制生长曲线。

4.结果分析标准的生长曲线近似S形，细胞刚接种前2天处于滞留期，增殖不明显：3-~7天进入对数增殖期，细胞生长旺盛，活力最佳；第8天进入平台期。在生长曲线上细胞数量增加一倍时间为细胞倍增时间，可以从生长曲线上面换算出，细胞倍增时间即细胞对数生长期，按照细胞倍增时间计算出群体倍增时间(DT)。DT=T×[lg2g(N2∧Nt)]，T代表生长曲线中的对数增殖时间段(12~1)，N是对数增殖期起始时间拐点的细胞数，N2是对数增殖末期的细胞数。

(二)脐带间充质干细胞的细胞周期检测

1.原理细胞内的DNA含量随着细胞周期进程发生周期性的变化，造血干细胞存储利用P标记的方法，利用流式细胞仪，将待检测的脐带间充质干细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，可以分析出细胞的DNA的含量以及各周期各时相的百分比。

2.仪器和试剂流式细胞仪、离心机、水浴、冰箱、70%乙醇(保存于4℃)， RNase-A(-20℃保存)、PI、PBS。

3.步骤分别取三组对数生长期的脐带间充质干细胞，胰酶消化成单细胞悬液，每管各1×10°个，PBS洗涤2次，用力打入5m70%(预冷)乙醇中，封口膜封口4℃过夜。PBS洗2次，用04ml的PBS重悬并转至Tbe中轻轻吹打，加入 RNase-A约3，水浴消化30分钟，加P约50u，在水浴中避光染色30分钟后流式细胞仪进行检测。通过 Multcycle-AV软件记录分析细胞周期结果。实验重复3次，取平均值。

4.结果分析细胞周期分析表明,80%的细胞处于G0~G1期，表明脐带间充质干细胞有丝分裂旺盛，增殖能力强。

(三)脐带间充质干细胞的形态特征观察

在倒置相差显微镜下，可以观察到原代培养的细胞少数长梭形贴壁生长的细胞组织块周围爬出，逐渐发展到围绕组织块呈克隆状生长。传代后可以观察到大量成纤维细胞样细胞呈漩涡状密集排列生长，呈现明显的方向性显示出典型的细胞形态特征。

总之， 造血干细胞存储UCMSO生长特性及细胞形态特征反映了其生物学特性，如果细胞培养过程中出现生长贴壁困难，生长速度缓慢，胞体增宽并在细胞内有较多黑色颗粒或脂肪滴，甚至出现凋亡小体或上清液中有较多细胞碎片，表明细胞老化和细胞活性较差，不宜用于实验研究。