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【免疫细胞存储】脐带间充质干细胞的免疫表型鉴定

2023-11-21 16:40:45


间充质干细胞表型标志鉴定是细胞质量鉴定的核心内容,是直接决定细胞究竟是不是间充质干细胞的判定标准之一。 UCMSC可表达多种抗原标志蛋白分子,4~8代的 UCMSO表面标志较为稳定,可表达CD10、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166及MHC-Ⅰ等细胞标志,低量表达移植相关的表面标记CD80、CD86和HLA-ABC,不表达CD14、CD31、CD33、CD34、CD45、CD56及HLA-Ⅱ类分子,免疫细胞存储也不表达共刺激分子,可以逃逸异体的T淋巴细胞和NK细胞的识别而在异体甚至异种体内长期存活。这些特性为它们作为组织工程的种子细胞提供了强大的理论根据,为自身免疫性疾病、器官移植及各种替代治疗方面的潜在应用价值提供了有力的支持。 UCMSC的免疫表型分析主要采用流式细胞分析术,也可采用免疫细胞化学染色法。这里主要介绍流式细胞分析术。

免疫细胞存储

1.原理采用流式细胞分析术对 UCMSC进行表型分析的基本原理是根据 UCMSC表达于细胞表面的标志分子,选取相应的荧光标记抗体进行特异性结合反应,然后通过流式细胞仪进行分类计数,从而计算出表达某种特定标志分子的细胞数量和比例。由于 UCSC缺乏特异性的表面标志分子,不能以单一的标志分子作为判定指标,免疫细胞存储需要选取一组或系列分子标志物作为检测指标,根据多种标志物的表达情况进行综合判定。对 UCMSC进行表型分析,实际上也是评价其是否具有干性和检测其纯度。基本方法是通过加入荧光标记的表面标志物抗体孵育后,应用流式细胞仪检测表面抗原情况。比如在人 UCMSC表型分析中,常用的阳性标志分子有:CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166及MHC-I,阴性标记常选用CD45和CD34等。

2.主要试剂和仪器流式细胞仪、荧光标记抗体、磷酸盐缓冲液。

3.操作步骤取体外培养的第三代(P3)的 UCMSC,弃除培养基,胰酶消化,生理盐水离心洗涤3次,计数活细胞,稀释并分装于孵育反应管中,1×10°个细胞/管,分别加入CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC5、CD90-FITC、CD105-PE和同型对照10ul,4℃避光孵育30分钟,磷酸盐缓冲液洗涤弃除未结合抗体后,按照流式细胞仪的操作程序进行表面抗原标志分子的表达分析。

4.结果分析采用流式细胞分析技术表明脐带间充质干细胞CD90、CD29、CD105和CD44呈阳性,阳性率不低于95%,CD45和CD34呈阴性,表达不高于2%,免疫细胞存储且同型对照均为阴性,从脐带分离出来的原代细胞PO通过传代除去杂细胞后,P3的阴性标志的细胞越来越少,而阳性标志的细胞越来越多,脐带间充质干细胞得到纯化(图6-4)。

5.质量控制同型对照均为阴性的情况下所得到结果才真实可靠。


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