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【造血干细胞存储】脐带间充质干细胞的分化潜能鉴定——成脂分化鉴定

2023-11-28 15:37:43


从干细胞的定义可知:干细胞的一个独特生物学特性就是具有分化潜能,这也是其用于疾病治疗和发育生物学研究的价值所在。 UCMSC在体内特定的组织微环境或体外特定的诱导培养条件下,可以分化为脂肪、骨、软骨等组织细胞,公认的 UCMSC分化潜能鉴定标准就是诱导向脂肪、骨和软骨细胞分化,以便鉴定 UCMSC是否具有多向分化能力。

造血干细胞存储

成脂分化鉴定

1.主要试剂

(1)脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液(诱导培养基):造血干细胞存储脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液基础培养基175ml胎牛血清20ml、双抗2ml、谷氨酰胺2ml、胰岛素400μ、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤200μ、罗格列酮200μul、地塞米松200u。

(2)脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基B液(维持培养基):脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液基础培养基175ml、胎牛血清20ml、双抗2ml、谷氨酰胺2ml、胰岛素400u

(3)其他:油红O、六孔板、PBS、中性甲醛。

2.步骤

(1)当培养的脐带间充质干细胞融合度达到80%~90%时,胰酶消化收集。

(2)将消化下来的细胞按照2×10clcm2的细胞密度接种在六孔板中,将细胞置于37℃,5%CO2的培养箱中进行培养。

(3)每隔3天换液,直到细胞融合度达到100%或者过融合。造血干细胞存储建议选择过融合状态的细胞做成脂诱导分化鉴定。

(4)小心的将间质干细胞完全培养基吸走,向六孔板中加入事先配好的2m脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基A液。

(5)诱导3天后,吸走六孔板中的A液,加入2ml脐带间质干细胞成脂导诱分化培养基B液。

(6)24小时后,吸走B液,换回A液进行诱导。

(7)A液和B液交替作用3~5次后(12~20天),继续用B液维持培养4~7天直到脂滴变得足够大、圆。B液维持培养期间,每隔3天需要换用新鲜的B液。

(8)成脂诱导分化结束后,吸走六孔板中的成脂诱导分化培养基,用PBS冲洗1-2次每孔加入2ml4%中性甲醛溶液固定30分钟。

(9)吸走中性甲醛溶液,用PBS冲洗2次。造血干细胞存储每孔中加入1m油红O染料工作液染30分钟(工作液配制方法:油红O贮存液:蒸馏水=3:2,混匀后用中性滤纸过滤即可)。

(10)吸走油红O染液,用PBS冲洗2~3次。

(11)将培养板置于显微镜下观察成脂染色效果,并拍照。

3.结果分析脐带间充质干细胞经过成脂分化诱导后,经油红O染色,可见明显红色脂滴。


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