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【干细胞存储】脐带间充质干细胞的免疫调节和自分泌功能鉴定

2024-01-05 09:58:16


除了上述体外跨胚层多向分化潜能鉴定之外, UCMSC还具有十分突出的免疫调节和自分泌功能,这在更多时候其实才是 UCMSC最主要的生物学功能及临床应用价值所在,因此,这些内容也应该成为 UCMSC质量鉴定的重要指标,而不是之一。

干细胞存储

(一)免疫调节功能分析

通常将 UCMSC与外周血淋巴细胞按一定比例(1:5、1:10、1:20、1:40)进行体外共培养3天后,干细胞存储检测淋巴细胞亚群比例的变化,结果T细胞的增殖率下降50%以上,调节性T细胞比例增加20%以上,CD8细胞比例降低,培养上清中的干扰素(IFN-y)含量下降。

1.原理异体来源的脐带间充质干细胞通过分泌可溶性的细胞因子,对人T淋巴细胞具有抑制作用。抑制作用与脐带间充质干细胞的数量呈正比。

2.试剂外周淋巴细胞分离液、六孔板、 Transwell离培养板、PHA、MI检测试剂盒。

3.步骤

(1)选择生长良好,干细胞存储细胞融合度达80%~90%的脐带间充质干细胞,胰酶消化后离心计数。

(2)按照2×10 cells/ml的细胞密度接种在六孔板中,并置于37℃,5%CO2的培养箱中培养。

(3)用外周血淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,用贴壁法分离得出T淋巴细胞,并计数。

(4)待脐带间充质干细胞贴壁后,按照 UCMSC:外周血T淋巴细胞为1:1、1:5、1:10、1:20的比例在 Transwell隔离的上层加入T细胞。每孔加入200μPHA刺激。置于37℃,5%CO2的培养箱中培养。

(5)脐带间充质干细胞和外周血T淋巴细胞共培养72小时后,把T淋巴细胞移入96孔板中,每孔加入20μMTS孵育2小时后,用酶标仪(490nm)测定各孔吸光度值。

(6)根据吸光度值来判断T淋巴细胞的活性。

4.结果分析在PHA的刺激下,T淋巴细胞的活性随着脐带间充质干细胞的数量增加而逐渐减弱。

(二)抗炎效应检测分析

釆用兔或灵长类急性关节炎模型进行评价,给动物模型通过静脉输入1×10°细胞/kg,隔日1次,连续3次,结果显示关节红肿消失,病理组织观察可见关节组织中浸润炎性细胞减少,关节液内的Ⅱ-1、TNF-a等炎性细胞因子含量降低。

(三)自分泌功能检测分析

UCMSC分泌数量众多的可溶性生物活性因子和外分泌体,干细胞存储通过检测培养上清中的这些活性因子和外泌体含量可初步判定 UCMSC的自分泌功能。外泌体的组成成分相对复杂,关于不同细胞产生的外泌在组成结构与功能方面的差异尚为完全阐明,一般检测 UCMSC的分泌功能分析以检测可溶性生物活性因子为主,重点是有选择性地检测促细胞生长类因子的含量。 UCMSC在体外无血清培养体系中或生理盐水培养24小时后,培养上清中新出现有多种涉及细胞生长、分化及免疫调节相关的可溶性生物活性因子,其中涉及促进细胞生长的因子有干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮细胞生长因子(VECF)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)肝细胞生长因子(HGF)骨形成蛋白(BMP)白介素类(L)、转化生长因子(TGF)等,可选择性地检测培养上清中的3~5种有代表性的生长因子的含量,作为判定 UCMSC自分泌功能的指标,也可根据实际情况进行蛋白质组学分析,全面评估 UCMSC的自分泌功能。


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