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【脐带干细胞存储】脐带间充质干细胞的冻存和复苏

2024-01-12 10:27:03


获得了质量合格的 UCMSC后,如何保存 UCMSC是个十分重要的大问题,因为临时制备 UCMSC不能及时满足实验研究的需要,更重要的是不能确保细胞质量,尤其是为了制备临床应用级别的 UCMSC时,只有建立规模化、规范化的 UCMSC冻存和复苏技术体系,才能适应 UCMSC的产业化发展要求。

脐带干细胞存储

一、UCMSC的冻存

用冻存液将细胞稀释成5×10细胞ml的密度,分装于冻存管后渐进降温,脐带干细胞存储zui终于-196℃的液氮中长期冻存。冻存液需要在完全培养基的基础上添加保护剂,以确保渗透性冷冻保护剂可在细胞悬液冻结凝固之前,渗透到细胞内,维持冻存过程中的细胞内外电解质平衡,保护细胞免受高浓度电解质的损伤,使细胞内的水分不会过分外渗,从而使细胞内外的渗透压基本一致。如果冻存临床应用级别的 UCMSC,则必须使用临床应用的消化液及冻存液才能确保临床应用安全。

冻存液的配制及选择

1.基础溶媒 UCMSC冻存液的配制过程中用到的基础溶媒介质主要为细胞培养液,使用这些介质的主要作用是作为细胞悬浮剂和输注的载体,如果是制备临床应用级别的UCMSC则需要使用临床上的常用药品。

(1)常用细胞培养液:如含10%血清的 DMEM/F12培养液。

(2)生理盐水:生理盐水中钠离子54mmo/L、氯离子154mmoL、pH50左右偏酸性、渗透压308 mOsmol/L,主要活性成分为氯化钠,而且其中不含任何营养成分。细胞悬浮于生理盐水中可能因缺乏营养易发生死亡聚集,从而减少有效细胞数量,并且聚集成团的细胞在回注时也会堵塞输血器及微血管,给临床上的使用带来不安全的因素。

(3)复方电解质注射液:脐带干细胞存储复方电解质注射液是一种接近于生理血浆的缓冲液,其中钠离子140mmol、钾离子5mmo/L、氯离子98mmo、pH74、渗透压294 mOsmol,都与血浆(钠离子142mmo/L、钾离子42mmo、氯离子103mo/L、pH74、渗透压3029m0smo)的生理浓度等同,避免高氯性代谢性酸中毒,具备强大的酸碱缓冲体系,使得溶液为生理性pH值,且能维持溶液的等张性。目前看,是一种较为理想的基础溶媒。

2.添加剂通常冻存 UCMSC时,不加各种添加剂,但为了增加保护细胞活性的可靠性时,可以考虑在基础溶媒基础上增加能源物质(如L-谷氨酰胺、腺苷)、抗氧化剂(N-乙酰半胱氨酸、亚硒酸钠)生长因子、抗凝剂(肝素钙)等。

白蛋白不仅具有维持血浆胶体渗透压和结合离子的能力,起到维持细胞外液的渗透压平衡的作用;而且人血白蛋白本身所带静电荷为负电荷,能够起到防止细胞集聚而处于分散状态的功能,另外,人血白蛋白是临床常用药物,容易获取且质量可以得到保障,加入到干细胞制剂中使用相对安全。在制备临床应用级别的 UCMSC时,可以考虑加入白蛋白。

3.细胞保护剂细胞保护剂包括渗透性细胞内冷冻保护剂(甘油、DMS0、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等)和非渗透性细胞外冷冻保护剂(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等)两大类。

(1)甘油又称为1,2,3-丙三醇,分子式CH2O3,分子量92.09,本品为无色、澄清的黏稠液体,与水或乙醇能任意混溶,常常作为溶剂和助悬剂和冷冻剂等使用,在冻存细胞的过程中发现甘油透过细胞膜的速度慢且会引起乳酸中毒,日前较少使用。

(2)DMSO又称为二甲基亚砜,分子式C2HOS,分子量78.13,本品为无色液体、无臭或几乎无臭,与水、乙醇或乙醚能任意混溶,本品的凝点较低,为170-183℃,常用作溶剂和防冻剂等;DMSO相对甘油分子量小透过细胞膜的速度更快,能够更好地保存细胞活性。DMSO本身具有一定的杀菌作用,通常可以直接使用,必要时只能采用过滤除菌法灭菌DMSO,切忌不能采用高压灭菌法处理,因为高压灭菌会破坏其分子结构,脐带干细胞存储导致冷冻保护效果降低。

二、脐带间充质干细胞的复苏

冷冻保存的 UCMSC从液氮中取出后,立即放入37℃的温水中并迅速摇晃使其快速融化为细胞悬液。为防止冻存管爆裂伤人,应该采取温水箱加盖或戴防护眼镜等预防措施。UCMSC的复苏应在1~2分钟内快速解冻,防止细胞内形成冰结和高浓度电解质而对细胞造成损伤。DMSO在常温下对细胞有一定毒性作用,解冻后的细胞悬液应立即离心洗涤尽快去除DMSO。特别注意:冷冻保存 UCMSC的保护效果与冷冻速度、冷冻温度和复苏速度有密切关系,只有操作得当,才能确保 UCMSC冷冻保存不会对细胞结构与生物学功能产生影响。如果是临床应用级别的 UCMSC注射液,由于细胞冻存液和包装都可以是直接临床应用,复苏就比较简单。

冻存和复苏是 UCMSC制备的zui后一个关键环节,“慢冻快融”是基本原则,程序降温系统的使用可以有效实现缓慢降温,温控监测系统的使用可以确保长期-196℃的恒定,只要特别注意细胞快速解冻复苏即可确保细胞的冻存质量。


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