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【造血干细胞存储】人脐带间充质干细胞分离扩增与纯化

2024-01-24 10:08:20


制备 hUCMSC注射液,分离扩增和纯化脐带来源间充质干细胞是十分重要的一个关键环节,必须严格遵照以下程序和要求完成。除了严格遵守普通间充质干细胞分离扩增的基

本程序和要求之外,必须特别注意符合国家卫生部门制定的临床生物制剂的特殊要求。

造血干细胞存储

1.在经检验合格符合GMP生产条件且具备完整的干细胞制剂制备质量管理体系的细胞工程实验室无菌条件下分离扩增脐带间充质干细胞,造血干细胞存储即取健康无传染性病原微生物(zui低检测标准至少应符合临床输血要求,HIV、HBV、HCV、梅毒、CMV检测为阴性)的洁净脐带一根,经注射用生理盐水反复冲洗三遍以后,在无菌的培养皿中剥离杂质,将脐带剪切为0.5cm长的若干段,再将每段脐带在EP管内剪碎为1mm3以下的糊状组织块。

2.使用临床应用级别的 DMEM/F12完全培养基悬浮糊状组织块,并将其转移到经检验合格可用于临床应用组织培养的T175细胞培养瓶中,加入10ml已调整好pH值的DMEMF12完全培养基,轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部,在5%C02、37℃、饱和湿度的培养箱中静置培养24小时。

3.适时在倒置显微镜下观察并视情况3~4天换液1次,7~9天后可见大量细胞贴壁生长。此时,用吸管轻轻吸出一半培养液,轻轻摇晃培养瓶,使组织块脱离瓶底,吸弃上清和悬浮组织块并接种到新培养瓶中,造血干细胞存储加入新鲜培养液继续进行培养,适时观察细胞并换液。至少反复进行3次重复贴壁培养,即可获得常规培养3倍数量以上的原代 hUCMSO。

4.培养2周左右细胞可长到8%以上融合状态,此时吸弃培养液并用生理盐水漂洗后,加入适量临床应用级别的0.25%的胰酶,充分混匀,观察到细胞收缩有部分细胞脱落时立即终止反应,收集细胞悬液到离心管中,300~400g离心10分钟,再加入生理盐水适量离心漂洗,反复3次后,计数活细胞,用完全培养基稀释,收集细胞进行传代培养。

5.传代培养通常采用专用细胞培养瓶,以 DMEM/F12培养基为基础,按原代培养密度1:3的比例进行传代培养。传代培养至第3代,即可获得相当数量的 hUCMSC。传代培养的过程是纯化间充质干细胞的过程。收集第三代以后的细胞用于鉴定,鉴定合格的hUCMSC用于制备 hUCMSC注射液。

6.长期在体外传代培养的是否会衰老、突变等一直是人们关注的问题,也是影响细胞质量的深层次问题。国外对骨髓间充质干细胞体外长期培养研究发现:如果在体外连续传代培养60次以后就会观察到间充质干细胞衰老和自动向脂肪细胞分化。笔者长期培养实验证明:造血干细胞存储在体外传代培养8次以内的脐带间充质干细胞安全性和活性是有保证的。连续传代8次以后,个别细胞会发生染色体变异。因此,笔者所在实验室制备 hUCMSC注射液使用的细胞是第3~5代的 hUCMSC。


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