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【造血干细胞存储】hUCMSC注射液的质量检验(一)

2024-02-29 17:30:35


为确保 hUCMSC注射液使用的安全性和有效性,应对生产的每一批次的 hUCMSC注射液进行质量检验,其中包括 hUCMSC中间产品(用于制剂配制前)和分装完成的终产品检验,检验的核心内容与前述的 UCMSO质量控制内容基本一致之外,还应包括临床生物制剂和干细胞生物学特性的质量控制要求。造血干细胞存储hUCMSO注射液制备机构应建立系统性的标准操作程序及质量检验方法和标准,通过严格执行 hUCMSC注射液制备的标准操作程序,从流程上zui大限度地确保产品质量合格、稳定,再辅以 hUCMSC中间产品(用于制剂配制前)的鉴定和zui终产品的系统批次检验,从关键环节上zui大限度地堵死产品质量的疏漏渠道,确保hUCMSC注射液完全合格。 hUCMSC注射液质量检验内容包括:

造血干细胞存储

1. hUCMSO形态检验,采用直接镜检法观察原代培养的 hUCMSO绝大部分(98%)呈成纤维细胞样,大量融合时平行排列或呈漩涡状生长,可见到2~3个核仁,胞质晶莹透亮。造血干细胞存储随着传代的次数增加细胞可变为扁平状,胞质内出现大小不等的颗粒。对于出现明显生长形态改变的 hUCMSC,不宜用于制备 hUCMSC注射液。

2.生长特性检验原代培养的 hUCMSC一般活性较好,传代后潜伏期短、细胞倍增时间短,细胞多为长梭形。经长期的培养后活性会有所下降,潜伏期变长,倍增时间延长,形态变扁平或变不规则。

3.细胞活性检验可采用不同的检测方法,如台盼蓝染色活细胞计数、细胞倍增时间、细胞周期等判断细胞活性及生长状况。

(1)活细胞计数:一般采用台盼蓝拒染法观察,如果细胞膜不完整或有破损,台盼蓝染料进入细胞内致使细胞变蓝,即为死细胞。如果细胞膜完整,细胞不被台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞,可以根据该公式计算细胞活率活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%,活细胞比例应>98%。

(2)细胞倍增时间:在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间,即倍增时间,一般通过生长曲线测定(计数法或MTS法)用正常完全培养基重悬细胞后需要调整浓度,再取01m孔加入96孔板培养,分别在培养的1、2、3、4、5、6、7、8天取出,造血干细胞存储换液后加入MTS检测试剂盒37℃培养4小时后,40m处检测吸光度值,以时间为横轴,吸光度值为纵轴绘制生长曲线。注意中途每3天给细胞换液。

(3)细胞周期:碘化丙锭(PI)染色流式检测法,由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的GG0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,可通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测,由此可知细胞周期的分布情况并确知细胞的倍体是否正常。 hUCMSC的细胞周期显示80%的细胞都处于C0/G1。


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